Gen Aktarım Teknikleri

Gen tedavisinde, etkin bir gen aktarımı en önemli bir koşuldur. Genleri
istenilen hücrelere taşıyabilmek için kullanılan yöntemler genel olarak
iki kategoride toplanmaktadır: Fiziksel yöntemler ve biyolojik
vektörler:

Fiziksel yöntemler, DNA'nın doğrudan doğruya enjeksiyonu, lipozom
formülasyonları ve balistik gen enjeksiyonu yöntemlerini içerir.
Doğrudan DNA enjeksiyonunda ilgili gen DNA'sını taşıyan plazmit,
doğrudan doğruya, örneğin kas içine, enjekte edilir. Yöntem basit
olmasına karşın kısıtlı bir uygulama alanı vardır.
Lipozomlar, lipidlerden oluşan moleküllerdir. DNA'yı içlerine alma
mekanizmalarına göre iki guruba ayrılırlar: Katyonik lipozomlar ve
pH-duyarlı lipozomlar. Birinci gurup lipozomlar artı yüklü
olduklarından, eksi yüklü olan DNA ile dayanıklı bir kompleks
oluştururlar. İkinci gurup lipozomlarsa negatif yüklü olduklarından DNA
ile bir kompleks oluşturmaz, ama içlerinde taşırlar. Parça bombardımanı
ya da gen tabancası olarak da adlandırılan balistik DNA enjeksiyonu, ilk
olarak bitkilere gen nakli yapmak amacıyla geliştirilmiştir. Bu ilk
uygulamalarından sonra, bazı değişiklikler yapılarak memeli hücrelerine
gen nakli amacıyla kullanılmaya başlanmıştır. Bu yöntemde, genellikle
altın ya da tungstenden oluşan 1-3 mm boyutunda mikroparçacıklar, tedavi
edici geni taşıyan plazmit DNA'sı ile kaplanır, sonra da bu
parçacıklara hız kazandırılarak, hücre zarını delip, içeri girmeleri
sağlanır.

Basit olmalarına karşın fiziksel yöntemler verimsizdir; ayrıca, yabancı
genler, sadece belirli bir süre fonksiyonal kalabilmektedirler. Bu
nedenle araştırmacıların çoğu, genellikle virüs kökenli vektörlere
yönelmişlerdir. "Vektör" kelimesinin bir anlamı da "taşıyıcı"dır. Benzer
şekilde, gen terapisinde genleri hücrelere taşıma amacıyla kullanılan
ve genetik olarak zararsız hale getirilmiş virüslere de vektör denir.

Günümüzde yapılan araştırmalarda, virüslerin hastalığa yol açan gen
parçalarının yerine, hastaları iyileştirme amacıyla rekombinant genler
yerleştirilmektedir. Bu amaçla değiştirilmiş hücreler kullanılmaktadır.
Bu hücrelere tedavi edici geni taşıyan bir genetik yapı sokulduğunda,
tedavi edici geni içinde taşıyan virüsler elde edilir. Bu şekilde
değiştirilmiş virüsler hücreye girmek için kendi yöntemlerini
kullanırlar ve genomlarının ekspresyonu sonucu, genin kodladığı protein
üretilmeye başlanır. Öte yandan, virüsün kendisini çoğaltmak için
ihtiyaç duyduğu genler, tedavi edici genlerle değiştirilmiş olduğundan,
virüs çoğalıp hücreyi patlatamaz. Bunu yerine, hücrede virüsün taşıdığı
hastalığı düzeltici genin ekspresyonu olur, genin kodladığı protein
(yani ilaç) üretilir ve genetik bozukluk nedeniyle üretilemeyen
proteinin yerini alır.
En çok kullanılan viral vektörler, retrovirüsler, adenovirüsler,
herpesvirüsler (uçuk virüsü) ve adeno-ilişkili virüslerdir. Ama her
vektörün kendine özgü dezavantajları vardır: Bölünmeyen hücreleri
enfekte edememek (retrovirüs), olumsuz immünolojik etkiler (adenovirüs),
sitotoksik etkiler (herpesvirüs) ve kısıtlı yabancı genetik materyal
taşıyabilme kapasitesi (adeno-ilişkili virüs). İdeal bir vektörde aranan
özellikler yüksek titraj, kolay tasarlanabilme, integre olabilme
yeteneği ve gen transkripsiyonunun kontrol edilebiliyor olmasının
yanında, imünolojik etkilerin olmamasıdır.



Gen aktarım teknikleri
Viral Vektörler:
1. Retroviral vektörler 2. Adenoviral vektörler


3. Adeno-asociated virus 4. Herpes Simpleks Virus Tip-1


5. Polio Virus 6. Ördek Hepatit Virusu


7. Parvovirus 8. Sendaivirus


9. Sindbis virus

Fiziksel ve Kimyasal Yöntemler

1. Transferin-reseptörü aracılığı ile 2. Asiaglikoprotein DNA
konjugatları

3. Lipofection 4. Direk aktarım

5. Kalsium fosfat çöktürmesi ile 6. Diethilaminoetil dekstran

7. Elektroporasyon 8. Sonikasyon

9. Kazıma yöntemiyle 10 Polibrene/dimetilsulfoksid

11 Jet injeksiyon 12 Partikül bombardımanı

Genlerin vücuda yerleştirilmesi yöntemleri

Genleri vücuda yerleştirmenin çeşitli yolları vardır. Genel olarak, gen
tedavisi iki esas bölümde sınıflandırılabilir.

l. ex vivo yaklaşım: Bu yaklaşımda hücreler vücuttan alınır; in vitro
kosullarda gen transferi yapılır. Tekrar vücuda geri verilir. Bu
yaklaşımın avantajları şunlardır:

a. Gen aktarımı genel olarak yüksektir.

b. Eger vektör seçilebilir marker gen taşıyorsa; gen aktarılan hücreler
zenginleştirilebilir.

c. Re-implantasyon öncesinde etkinlik kontrol edilebilir.

2. in vivo yaklaşım: Vücuttaki hücrelere genlerin direk transferidir. Bu
aktarım, in vitro koşullarda gerçekleştirilir ve hücreler alıcıya
tekrar geri verilerek yapıldığı gibi alıcının dokusuna in situ direk
aktarım şeklinde de yapılabılır. Ayrıca henüz kullanılmamakta ise de bir
vektör aracılığı ile de kan yoluyla aktarım gerçekleştirilebilir. Bu
vektörler plasmidin konakçı hücrede takibini sağlayacak şekilde
flöresans ile işaretlenebilir. En önemli sorun spesifiklik ve durağan
gen transferinin düşük etkinliğidir. Bu klinikde arka arkaya tedavi
işlemlerini gerektirmektedir.

Gen tedavisinde antisens oligonükleotid kullanımı

Antisens oligonükleotidler, küçük sentetik nükleotid dizileri olup;
bunlar spesifik DNA veya RNA dizilerine komplementerdirler. Eksojen
oligonükleotidler nükleik asit bağlayıcı reseptörler aracılığı ile hücre
içerisine alınırlar. Terapötik ürün olarak hazırlanmalarında başlıca
sorun hücre içerisine taşınabilmeleridir. Oligonükleotidlerin gen
tedavisinde kullanılması ‘eğer belirli bir gen bir hastalıktan sorumlu
ise; bunun çalıştırılmaması klinik anormalliğin düzelmesini
sağlayabilir’ prensibinden yola çıkarak tasarlanmaya başlanmıştır.
Antisens oligonükleotidler genin çevrilmesini durdurarak hastalığa neden
olan genlerin ekspresyonunu engelleyen yapılardır. Bu yapılar
onkogenleri kontrol altına alabilmekte ve virüs DNA’sının çevrilmesini
engelleyebilmektedirler.

Bir çok ilaçda amaç defektif veya istenmeyen proteinin sentez edildikten
sonra fonksionuna engel olmaktır. Antisens teknolojide amaç protein
sentezinin spesifik kısa tek sarmal DNA veya RNA dizileri kullanılarak
önlenmesidir.

Bu önleme, protein sentezinin:

1) Genomik DNA'nın mRNA'ya transkripsiyonunda

2) mRNA'nın proteine translasyonu sırasında mümkün olabilir.



Sitoplazmik mRNA, DNA 'ya oranla daha kolay bir hedef gibi
görünmektedir. Bu yaklaşımla, c-myc geni/lenfoma hücre dizileri bcr-abl/
Kronik Myelositer Lösemide blast hücrelerinde denemeler yapılmıştır. In
vitro çalışmalarda, anormal mRNA oluşturan Burkitt lenfoma hücre
dizilerinin çoğalması antisens oligonükleotidlerle durdurulmuştur.
Antisens oligonükleotidler, hücre dizilerinin kanserleşmesini veya
metastatik potansiyellerini azaltır.



Anti-sens olarak geliştirilen ve AIDS'li hastalarda oluşan
sitomegalovirus retinitini tedavi edecek olan ilaç intra vitreal
enjeksiyonla 1998 yılında insanda kullanılmaya başlanmıştır.

Oligonükleotid ile gen modifikasyonu
Amaç DNA'da var olan hatanın, yapısal DNA hatasına dönüştürülerek, tamir
mekanizmasının tanıyabilmesini sağlamaktır. 20 bazlık bir
oligonükleotide bağlanan bir alkile edici ajan, ikili helikse yapışır.
Tek iplikçikli oligonükleotid hedef DNA'da kendisine uyan bölgeye
yapışır. Replikasyon sırasında, hücre tamir mekanizmaları devreye girer
ve düzeltmeyi yapar.

Bu metod ile obesite, b-adrenerjik reseptör mutasyonu, Hb S ve kistik
fibrozisin gen tedavisi çalışmaları yapılmaktadır.



Genetik immünomodülasyon:

Genetik immünomodülasyon, gen tedavisinde sitokinleri kodlayan genlerin
vektörler aracılığı ile aktarılmasını kapsamaktadır. Sitokinlerin,
klinik olarak tümör büyümesi üzerine önemli etkisi vardır. Immün
sistemde yapılacak modifikasyonla, konakçının antitümör immün yanıtı
geliştirilebilir. Tümör infiltre eden lenfositlere TNF geni aktarılması
modeli bunun bir örneğidir.



İlaç hedeflemesi:

Gen tedavisinde kullanılan vektörlerin spesifik olarak hastalıklı
hücrelerde eksprese olurken normal hücrelerde bunun oluşmaması temel
amaçtır.

Değişik doku ve hücrelerde gen tedavi yaklaşımları aşağıda
özetlenmiştir.



Kemik iligi: Kemik iliği transplantasyonu için gerekli olan teknik
işlemlerin ve tedavinin geliştirilmesi ile hematopoetik sistem gen
tedavisi için uygun bir aday doku olmuştur. Pluripotent hematopoetik kök
hücre, kemik iliği hücrelerinin %0.01-0.1'i kadardır. Pluripotent
olması ve kendiliğinden yenilenmesi, ideal bir hedef doku halini
almasını sağlar. Ex vivo tedavinin en güzel örneğidir. Bir kaç hücreye
bir gen aktarımı olması halinde dahi, aktarılan genin sürekli varlığı
mümkün olacaktır. Yüksek sınıf hayvanlarda, bu hücrelerin enfekte
edilmesi güçtür. Kemik iliğindeki bağ dokusu hücrelerinin etkin
transferde önemli rolü olduğu gösterilmiştir. Kemik iliğinin gen
tedavisi için ilk hedef doku olmasının nedenleri şöyle sıralanabilir.

1- Kemik iliği hücreleri kolayca elde edilebilir.

2- In vitro olarak çalışılabilirler.

3- Bireye tekrar reinfüze edilebilirler.

4- Infüzyon sonrası organizmada çoğalarak, farklılaşmaya uğrarlar.
Böylece organizmada yeni bir hücre popülasyonu oluşturulabilir.



Kas: Çok sayıda hedef hücreye gereksinim olduğundan; yüksek etkinlikte
gen transferine ihtiyaç vardır. Retrovirusla infekte edilen primer
myoblastların hayvan kası içine zerk edilmesi ile altı aylık bir sürenin
üzerinde gen ekspresyonu sağlanmıştır. En önemli dezavantajı,
myoblastların zerk edildigi bölgede kalmasıdır. Adenovirus vektörünün
intravenöz olarak sıçana verildikten sonra, etkin bir transduction hem
kas fibrillerinde, hem de diğer dokularda sağlanmıştır. Kas
fibrillerinin in vivo direkt gen aktarım teknikleri için de
kullanılabildiği gösterilmiştir. Plazmid DNA'nın iskelet ve kalp
kaslarına direkt zerki ile durağan gen ekspresyonu sağlanmıştır. Bu zerk
edilen plazmid DNA'sı hücrede episomlar olarak bulunmaktadır. Bu
prosedür, primatlarda çok etkin değildir.Insan büyüme hormonu genlerinin
transferi ile de hayvanlarda bu hormonun düzeyleri üç ay sonra
belirlenebilmiştir.



Karaciğer: Hepatositleri, kültür ortamında manüple etmek oldukça güçtür.
Çünkü bu hücreler kültür ortamında çok az bölünmeye uğrarlar ve
retroviral vektörlerle transduction etkinliği %20-25 gibi düşük
düzeylerdedir. Her ne kadar in vivo olarak, hepatositler normal
koşullarda bölünmezken, kısmi hepatektomi, hepatositlerin hücre
bölünmesini aktive eder. Bunu takiben retrovirus vektörünün in vivo
perfüzyonu ile çok sayıda hepatosit infekte edilebilir. Ancak etkinlik
%1-2 civarındadır. Alfa-1- antitrypsin geni intraportal yolla adenoviral
vektörle karaciğere aktarılmışsa da, genin ekspresyonu kısa sürmüştür.



Santral sinir sistemi: Yapısal ve fizyolojik kompleksliği nedeni ile SSS
bozukluklarında somatik gen tedavisi uygulanması beraberinde önemli
sorunları da getirmektedir. HSV-1 vektörleri hem in vivo, hem de ex vivo
olarak sinir hücrelerinde aktarımda kullanılmıştır.



Trakea epiteli: Bu hücrelerin organizma dışına alınıp, kültüre edilmesi
ve sonra tekrar organizmaya implante edilmesindeki zorluklar nedeni ile
in vivo aktarım kullanılmaktadır. Adenoviral vektörler ile trakea
epiteline invivo gen aktarımı, sıçanlarda başarılmıştır.



Lenfosit: Adenosine Deaminaz enzim eksikliğinde kullanılmıştır. T
hücrelerinin yaşam sürelerinin sınırlı olmasının nedeni ile arka arkaya
infüzyona ihtiyaç bulunmaktadır. AIDS ve kanser tedavisinde en uygun
hedef doku olarak ortaya çıkmaktadır.



Oküler hücreler: Vitröz içine adenovirus aracılığı ile gen aktarımı
yapılmıştır.



Periferik kan progenitör hücreler: Kemik iliği yerine, periferik kandan
izole edilen progenitör hücrelere gen transfer edilmesi ile uzun süreli
hematopoesis saglanmıştır.



Umbilikal ven epiteli: Umbilikal ven epiteline "Doku Faktör" transferi
yapılmıştır.



Gen Terapisinin Çözüm Bekleyen Sorunları:

İlk sorun, genlerin insana verilmesini sağlayacak daha kolay ve etkili
yöntemlerin bulunmasıdır. Bir başka sorunsa, nakledilen genin hastanın
genetik materyalinin hedeflenen bölgesine yerleşmesini sağlamak ve
böylece olası bir kanser ya da başka bir düzensizlik riskini ortadan
kaldırmaktır. Bu konudaki başka bir sorun da, yerleştirilen yeni genin
vücudun normal fizyolojik sinyalleriyle etkin bir biçimde kontrolünün
sağlanmasıdır. Örneğin insülin, doğru zamanda ve doğru miktarda
üretilmediği zaman, hastaya yarar yerine zarar getirecektir. Şu ana
kadar yapılan çalışmalar sonrası iyi sonuçlar alınabilmiş fakat kalıcı
tedavi çoğu zaman başarılı olamamıştır. Bunun bir nedeni, vektörlerin
taşıdıkları genin uzun süreli ekspresyonuna izin vermeyişleri, diğeriyse
denemelerde etkinlikten çok güvenliğin ön plana çıkmasıdır.

Şu anki duruma göre, önümüzdeki yıllarda gen tedavisindeki eğilim,
genleri istenilen hücrelere en etkin biçimde taşıyabilecek vektörlerin
dizayn edilmesi yolunda olacak gibi görünüyor. O zaman, gen tedavisinin
daha başarılı sonuçlar vereceği söylenebilir